5'-核苷酸酶的作用有參與人體代謝、輔助疾病診斷、鑒別診斷疾病等。

1.參與人體代謝

5'-核苷酸酶是一種特殊的磷酸酯水解酶，可作用于多種核苷酸，參與嘌呤代謝和核酸分解過程，在人體內的含量相對穩定。

2.輔助疾病診斷

5'-核苷酸酶廣泛存在于人體組織，如肝、膽、腸等，是肝臟疾病和骨骼疾病的診斷指標之一。它主要用于肝膽系統疾病的診斷，如原發性肝癌、膽道癌等，可協助診斷膽汁分泌性肝臟疾病，鑒別診斷肝細胞性黃疽和阻塞性黃疽。

3.鑒別診斷疾病

與血清堿性磷酸酶（ALP）聯合檢測，5'-核苷酸酶有利于鑒別血清ALP升高是肝膽疾病還是骨骼疾病導致。