迄今為止,感染尖銳濕疣的HPV病毒難于用傳統的病毒培養及血清學技術檢測,主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點,為HPV檢測開辟了新途徑。
(一)標本的采集及處理
標本的采集和預處理:用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。標本核酸的提取,按1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液37℃下處理過夜;
(二)PCR擴增
1、 引物設計和合成:HPV基因組可分為早期區(E)和晚期區(L),每區含一系列開放讀碼框架(ORF)。
2、PCR反應試劑:Taq DNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/L dNTP貯備液,10×PCR緩沖液,100μmol/L MY11和MY09貯備液,滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。
3、PCR擴增方法和程序:以100μl PCR反應液,用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應管進行擴增反應。
(三)擴增產物的檢測和分析
1、凝膠電泳:擴增反應結束后,取出反應管,冷卻至室溫,取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳,溴化乙錠染色,紫外分析儀下分析結果,分子量約為450bp處出現明顯的DNA帶。
2、核酸雜交:如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時,可用標記的公用混合探針和(或)型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。
用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高,GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結果,可檢出標本中200個拷貝的HPV DNA,若以核酸雜交檢測PCR產物,敏感性提高,能檢出10個拷貝的HPV DNA。
鑒于PCR技術的高度敏感性,以生殖道脫落細胞為檢材足以滿足試驗要求,避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下,PCR擴增產物經凝膠電泳,觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此,PCR技術檢測HPV實驗周期短、簡便快速。