肥厚型心肌病有心室流出道梗阻的患者，因具有特征性臨床表現，診斷難度不大。超聲心動圖檢查對肥厚型心肌病的診斷幫助很大，是極重要的無創性診斷工具。室間隔厚度大于等于18厘米，并有二尖瓣收縮期前移，足以區分梗阻性和非梗阻性患者。有的病人臨床上無癥狀，在經超聲心動圖檢查后便可提示存在肥厚型心肌病。左心導管檢查和心室造影，可以證實診斷是否正確。
臨床上聞及胸骨下段左緣收縮期前雜音，懷疑是梗阻型肥厚型心肌病時，可以通過改變左室流出道收縮期壓力差觀察雜音變化進而幫助診斷。
具體方法可采用：
含化硝酸甘油，吸入亞硝酸異戊酯。滴入異丙腎上腺素，作Valsalva動作時或用洋地黃類強心藥后，體力勞動后或過早搏動后，心肌收縮力加強或靜脈回流減少，左室流出道梗阻加重，雜音增強。
用血管收縮藥，如去甲腎上腺素等;在下蹲、緊握拳時，應用β-受體阻滯劑，如普萘洛爾等;心肌收縮力減弱或周圍阻力增強或靜脈回流增加，左心室流出道梗阻可減輕，聽診時雜音減弱或明顯減弱。但近年來，隨著心臟超聲技術的日益進步，藥物試驗的方法用的已經很好。
肥厚型心肌病尤其是梗阻型診斷的確立，還需與室間隔缺損、主動脈瓣狹窄、風濕性二尖瓣關閉不全、冠心病等疾病鑒別診斷。